Биомембрани

Това е материал, който не е предоставен от доц. Денев, но би бил полезен, в процеса на подготовка за изпита:

I. Структура, състав, функция и свойства на мембраната. Типове мембранни модели. Междумолекулни взаимодействия в мембраната.

I.1 Свойства и функции на биологичната мембрана

Мембраната е жизнено необходимо образувание и нейното разрушение води до загиване на клетката. Тя не представлява просто обвивка на клетъчното съдържимо, а регулира постъпването и отделянето на молекули и йони от и в околната среда. Освен това, в мембраната се намират различни ензими и рецептори, природата на които зависи от особеностите на всеки вид клетка. При изследване на биомембраните се изучават техните функции. Мембраните се различават в зависимост от функциите си, но всички мембрани притежават няколко общи функции:

1)        компартментализация – мембраната образува компартменти (сектори), различни по своите физични и химични характеристики. Във всеки сектор се реализират конкретни процеси. Целта е да се локализира даден процес в даден компартмент, за да не се наслагват два  паралелни процеса един върху друг и да са отделени в пространството. Това свойство на мембраната се нарича компартментализация.

2)        полупропускливост.

o    градиенти:   рН,  концентрационен.

Мембраната създава електричен градиент с малки на пръв поглед стойности (0.1V). Но ако трябва да се прецени напрежението на електричното поле – 0.1 V/10^-6 sm = 10⁵ V/ sm потенциална разлика. Това показва, че  материалът, от който е изградена биологичната мембрана, трябва да има такива свойства, които да не позволяват самопроизволен пробив. В някои клетъчни органели – пр. митохондрии, наред с другите процеси протича и процес на топлоотдаване и вътрешната част на тези органели е нагрята. Мембраната трябва да е като електроизолатор, който може да поддържа високи стойности на потенциала.

o    електрически потенциали.

o    осмотична сила, температура.

3)        регулаторна – много съществена функция. На повърхността на мембраната има много ензими, които участват в различни процеси; необходимо е те да бъдат подходящо организирани, за да не си пречат. Мембраната прави именно това-тя организира всички ензими в един голям ензимен комплекс.Това позволява всеки ензим да влезе в ролята си след като предходния е осъществил действието си.

4)        обмен на информация.

Наред с общите съществуват и специфични за мембраните функции:

1)        трансформация на енергия – в митохондрии и хлоропласти; макар източниците на енергия да са различни, устройството и начинът на функциониране са много подобни един на друг.

2)        генериране и предаване на електрични импулси (в нервните клетки); предаването се осъществява с максимална скорост, но по-важното е, че самото предаване трябва да осигури  надеждност и възможност за регулация на тези импулси в определени честоти.

3)        трансдукция на информационни сигнали в електрични импулси – наблюдава се при сетивните органи и клетки, които участват във възприемането на светлина (фоторецепторните мембрани задължително имат пигменти, които играят ролята на биологични филтри като отсичат определена област от светлината, където реагират на светлинния квант), мирис (в обонятелните клетки се възприемат миризливите вещества), звук, температура, налягане и т.н.

I.2. Типове мембранни модели

1.         Първите представи за структурата на мембраните се  свързват с предположението, че те се състоят от тънък слой липиди. През 1925 г.  холандските изследователи  Гоpтер и Грендел (E.Gorter, F.Grendel) откриват, че площта на монослоя, получен от липиди, екстрахирани от еритроцити, е два пъти по-голяма от общата площ на еритроцитите. Изводът е, че липидите в мембраната са разположени в двоен молекулен слой, при който хидрофилните им групи  се намират на повърхността, а въглеводородните им вериги образуват вътрешната хидрофобна част. Изводът се потвърждава от данните за високото електрично съпротивление на клетъчните мембрани.

2.         При измерване повърхностното напрежение на големи клетки е  установено, че за техните мембрани то е по-ниско, отколкото за липидите.  Това дава основание да се предположи, че ниското повърхностно напрежение се обуславя от белтъчни слоеве, покриващи липидните компоненти. Анализирайки тези данни, Даниели и Давсън (J. Danielli, H. Davson, 1935) предлагат модел, наречен липопротеинов сандвич. Според този модел мембраната е трислойна структура, при която двойният липиден слой се намира между два слоя на глобуларни белтъци, образуващи граничните повърхности на мембраната с водата.  По-късно (1956 г.) Даниели и Стейн (W. Stein) усъвършенстват модела така, че да отразява възможността за хидрофобни взаимодействия на неполярните странични вериги на аминокиселинните остатъци с липидните молекули и да обяснява лесната дифузия на някои водоразтворими нискомолекулни вещества. Те предполагат, че белтъците се намират по повърхността на мембраната  в разгъната конформация, а техните алифатни вериги частично проникват в липидния бислой. В отделни участъци те напълно го пронизват, образувайки в него пори, през които могат да преминат водоразтворими вещества.

Според съвременната представа (S.Singer, G.Nicolson, 1972г.), молекулната организация на мембраната  може да се представи като течно-мозаечен модел (фиг.1). Според него, структурна основа на биомембраните е липидният бислой, в който въглеводородните вериги на фосфолипидните молекули се намират в течнокристално състояние. В бислоя са потопени белтъчните молекули, способни да се придвижват в мембраната. Освен белтъците във фосфолипидния бислой са потопени и молекули на холестерола, които са по-къси и твърди от липидните молекули.

Един от основните постулати на модела е предположението за свободно движение на липидните и белтъчните молекули. По-късно става ясно, че не всички липиди и белтъци могат да се преместват свободно, а в някои случаи тяхната подвижност е силно ограничена.

I.3 Взаимодействия липид - вода

Във водни разтвори и на разделителната граница вода/въздух липидите образуват гигантски  агрегати (асоциати), които донякъде наподобяват биологичните макромолекули. Сформирането на много различни фази (начини на подреждане на липидите) в различно съотношение липид/ вода е известно като лиотропен мезоморфизъм. Най- известните взаимодействия липид – вода са:

1)        монослоеве (фиг. 2) – образуват се на разделителната границата вода/въздух или вода/масло, при наличие на  много малко липиди във вода. Алтернативен начин за подреждане на липидите във вода са мицелите – това са най-простите агрегати, които липидните молекули могат да образуват в обемна фаза на разтворителя. Мицелите са обикновени или обърнати.  В обикновените мицели, хидрофилните глави на липидните молекули са обърнати към водната фаза, а въглеводородните вериги образуват хидрофобно ядро, изолирано от водното обкръжение. Обърнатите мицели се получават в неполярни разтворители – полярите глави оформят централната хидрофилна област, а хидрофобните вериги са насочени към разтворителя   (в случай, че е на лице много малко количество вода и обилно липидно обкръжение). Размерите на полярната и неполярната част на молекулата са от значение за способността на липидите да образуват мицели. Във вода лесно образуват мицели онези липиди, които имат обемиста полярна глава и/или сравнително неголеми въглеводородни вериги. Малки по обем полярни глави и масивни въглеводородни вериги образуват обърнати мицели в неполярни разтворители.. Концентрацията, при която възникват мицели,  се нарича критична концентрация на мицелообразуване.

2)        липозома (фиг. 3) – това е структура, подобна на биологичната мембрана. Начинът на образуване се състои в разтваряне на липидите в органичен разтворител; след изпаряването на последния, се формира липиден филм и ако към него се прибави вода, след разклащане се образуват липозоми. Това са мултибислойни комплекси, т.е. коаксиално включени множество липидни бислоеве.

3)        хексагонални структури (фиг.4) – много мицели се събират и не образуват сферични форми, а фибриларни. Тези образувания взаимодействат по 6 по между си и се събират. Тази форма е енергетически най-изгодна. Могат да съществуват и обърнати хексагонални структури. Когато количеството вода е много по-малко от количеството на липидите се образуват обърнатите мицели – главата на липидните молекули е насочена навътре, а опашката – навън.

I.4. ХИМИЧЕН СЪСТАВ НА БИОМЕМБРАНИТЕ

Съставът на биомембраните е характеристика на отделните видове клетки, тъй като зависи от цитологичния вид, видовете тъкани и организми. Мембраната представлява много голям комплекс, организиран по определен начин: всяка мембрана е изградена от два монослоя липиди като полярната част на молекулите са във външността на бислоя, а неполярните – в средата. В този бислой се включват мозаечно подредени и свързани по определен начин с липидите белтъчни молекули. Така се осъществява пропускливост, еластичост и пластичност на мембраната.

Съдържанието на вода в мембраните е около 20-30% от свежата им маса. Основната част от нея образува хидратна обвивка около полярните части на липидните и белтъчни молекули. Тази вода не е осмотично активна и не може да разтваря вещества. Освен нея има и свободна вода, а понякога има и захваната вода между липидните слоеве.

Основните компоненти на биомембраните са липиди и белтъци. В зависимост от вида на мембраната, съдържанието на липидите варира от 15 до 80% от сухата маса, а на белтъците от 20 до 85%. Мембраните съдържат и около 10-15% въглехидрати, свързани към молекули на белтъци (гликопротеини) или липиди (гликолипиди).

Липиди

Липидите са особена група вещества, които са много различни по своята химична природа, но се обединяват от факта, че не се разтварят във вода, а само в органичен разтворител.

Компактните хидрофилни (разтворими във вода) групи образуват полярната глава на молекулата в единия й край, а въглеводородните радикали, които имат слаб афинитет към водата, са наречени хидрофобни опашки. Такива молекули, които имат едновременно хидрофилна и хидрофобна част се наричат амфифилни или амфипатични. От съотношението между полярната и неполярната част (фиг. 5) се определя и формата на молекулата: при голяма полярна и малка неполярна част, молекулата има форма на обърнат конус (< ½), обратно – при малка полярна част и голяма неполярна – формата е конус ( >1), а при почти еднаква големина формата е цилиндър ( ½ – 1). Критерият за формата на липида е: V / (l - S₀), където: V – молекулен обем на въглеводородната област, l – дължина на въглеводородната верига, S₀ – оптимална площ на молекулата в бислоя.

 Полярната част на липидите може да бъде захар (тогава говорим за гликолипиди), аминокиселина (аминолипиди), фосфорна киселина (фостолипиди). Неполярната част  представлява остатъци (един или два) на мастни киселини, а дължината на въглеводородните опашки е от 16 – 20 атома. В зависимост от фактора, който участва в свързването на полярната глава с хидрофобната опашка се наблюдават:

q   глицеролипиди- свързващото звено е глицерол (пр. кардиолипин).

q   сфинголипиди – свързващото звено е сфингозин (сфингомиелин) (фиг.6). Те могат да бъдат: церамиди – когато липсва фосфорилхолинът, церебразиди – когато фосфорилхолинът е изместен от галактоза, сулфатиди – една от ОН-групите на въглехидрата е естерифицирана с H₂SO₄. Имат много висок (–) товар.

Полярните глави на всички липидни молекули са отрицателно заредени или електрически неутрални. Това е важно, тъй като сумарният отрицателен електричен заряд на мембраната играе съществена роля в поведението на клетките. Силите, които свързват липидните молекули в агрегати, са преди всичко хидрофобни сили между опашките на молекулите. Върху тях влияят и електростатичните сили между полярните им глави. В хидрофобната част  липидите включват висши мастни киселини с дълга, неразклонена въглеводородна верига. Те могат да бъдат наситени или ненаситени киселини; ненаситените мастни киселини могат да бъдат с една или няколко двойни връзки (фиг.7). Лизолипиди – това са едноверижни липиди (с един остатък на мастна киселина). Често те са резултат на действието върху двуверижни фосфолипиди на фосфолипази А1 и А2, които са ензими, разграждащи фосфолипидите (хидролизират МК в първо и второ положение); лизолипидите могат силно да променят структурата на липидния бислой, мембраната не може да създава градиенти и се променя пропускливостта й. Такива ензими се съдържат в змийската отрова.

Фосфолипиди

Фосфолипидите са главните компоненти на биомембраните и съставят 40-90% от мембранните липиди. Към тях спадат фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилглицерол, фосфатидилетаноламин, фосфатидилинозитол. Фосфатидите или фосфолипидите са диестери на фосфорната киселина – естерифицирана от една страна с глицерол или сфингозин, а от друга, с етаноламин, холин, серин или инозитол. Според това дали в състава на фосфолипидите участва глицерол или сфингозин, те се делят на глицерофосфатиди и сфингозинфосфатиди. При глицерофосфатидите едната хидроксилна група на глицерола е естерифицирана с фосфорна киселина, а двете останали - с различни алифатни монокарбоксилови киселини. Такива структури се наричат фосфатидинови киселини. Ако при фосфатидите фосфорната киселина се естерифицира допълнително с холин, се получават лецитини. При фосфатидилинозитолите фосфорната киселина е естериифицирана вместо с азотсъдържащ алкохол с алкохолът инозитол. Това е единствената група фосфолипиди без азот. В молекулата на фосфатидилетаноламинът (фиг.8) глицеролът обединява полярната и неполярната част. Едната от двете опашки е без двойна връзка, а другата е с една или повече ненаситени групи. Полярната част включва фосфорен остатък, който се свързва с друга фосфатидна киселина и към нея се свързва аминокиселина или етаноламин. Зарядът на липидната молекула се променя ако една от анимогрупите се протонира; възможно е депротониране и зарядът да изчезне.

Сфингозинфосфатидите съдържат вместо глицерол ненаситения, висш, двувалентен аминоалкохол сфингозин. Единствената двойна връзка при сфингозина има транс - конфигурация. При тези съединения една от хидроксилните групи е естерифицирана с фосфорилхолин, а аминогрупата е свързана киселинноамидно с висша мастна киселина. Сфингомиелин без фосфорилхолин се нарича церамид. Съществуват производни на сфингозина структури, които вече на съдържат фосфорна киселина – това са церебразидите. При тях, фосфорилхолинът е заместен с гликозидно свързан монозахарид- обикновено галактоза. Още по-сложна е структурата на ганглиозоидите. При тях мястото на монозахарида (галактоза) при цереброзидите се заема от холозидна съставка, съставена от разнообразни монозахаридни остатъци - например гликоза, галактоза, към някои от които е прикрепена и невраминова киселина. Съществува голямо разнообразие от ганглиозиди по отношение на олигозахаридния компонент. Глицерофосфатидите, сфингозинфосфатидите, церебразидите и ганглиозидите образуват групата  на т.нар. комплексни липиди. Церебразидите и ганглиозидите са комплексни липиди, които съдържат и въглехидратен компонент. Затова те от своя страна се отнасят и към гликолипидите.

Холестеролът се различава по химичен строеж от липидите, но има сходни с тях физикохимични свойства.  Съдържанието на холестерол в мембраните достига до 35%. Той се намира главно в цитоплазмените мембрани на еукариотите, а в по-малки количества във вътреклетъчните мембрани. Холестеролът е неразтворим във вода, но се разтваря лесно в органични разтворители и оказва влияние върху свързването и подвижността на липидите в мембраната. Холестеролът (фиг.9) притежава малка полярна част, голяма неполярна част и само една ОН-група. Той лесно се вгражда в мембраните и по принцип се намира в неполярната им част. Холестеролът е и главния регулатор на флуидността на мембраните.

Латерална дифузия на липидите

Течнокристалното състояние на мембраната позволява липидите и белтъците да се преместват в нейната равнина. Това преместване се нарича латерална дифузия (фиг.10) и протича с доста висока скорост. В зависимост от липидния състав, условията на околната среда и действието на различни мембранно транспортни агенти, липидните молекули могат да имат нехомогенно разпределение в бислоя. Между различни домени на бислоя се извършва преразпределение на липидни молекули, което показва, че те лесно мигрират по неговата повърхност. Скоростта на латералната дифузия рязко спада при преход на бислоя от течнокристално състояние в кристално.

Напречна дифузия на липиди

Мембранните липиди могат спонтанно да се преместват от единия монослой в другия. Това преминаване през бислоя с нарича напречна дифузия или за него се използва термина flip-flop (фиг.10), тъй като прескачането на една липидна молекула в едната посока се придружава от прескачане на друга молекула в другата посока. За разлика от латералната дифузия, напречната е много бавна. Като мярка за нейната скорост се въвежда величината полупериод на напречната дифузия. Той се дефинира като време, за което половината от липидните молекули на единия монослой преминава в другия. Полупериодът е от порядъка на няколко часа и даже дни. Причината за изключително бавния flip-flop е неговата енергийна неизгодност, тъй като полярната глава на липидната молекула трябва да премине през хидрофобната област на бислоя.

Течнокристално състояние на липидния бислой

В  зависимост от температурата липидния бислой може да се намира в две основни фазови състояния – във вид на твърд двумерен кристал (гел) или в течнокристално състояние. Състоянието на липидния бислой в зависимост от температурата се нарича термотропен мезоморфизъм. Този преход протича в определен температурен интервал, характерен за всеки липид. Затова под температура на фазовия преход Т_р се разбира температурата, при която половината от фосфолипидните молекули в бислоя са в твърдо, а другата половина в течнокристално състояние. Липидният бислой на функциониращите мембрани се намира в течнокристално състояние. Фазовият преход е кооперативен процес, тъй като засяга едновременно няколко съседни липидни молекули в определен участък от мембраната.  При наличие на фазов преход се променят площта на бислоя (увеличава се), дебелината на бислоя (намалява), обемът на бислоя (нараства). Температурата на фазовия преход зависи главно от строежа на въглеводородните вериги на липидните молекули. По правило, колкото по-дълга е въглеводородната верига, толкова Т_р  е  по-висока. Твърдото състояние се характеризира с плътна опаковка на въглеводородните вериги, каквато е възможна при наситените вериги. Наличието в бислоя на двойни връзки също е от особена важност. Наличието на цис-двойна връзка в едната верига на липидната молекула рязко понижава Т_р, тъй като огъването на тази верига нарушава плътността на опаковката между нея и съседните. Още по-ниска става Т_р, когато и в другата верига има такава връзка. Степента на понижение зависи и от положението на връзката във веригата- ефектът е най-голям когато тя се намира в средата (при въглероден атом 9 или 10). Т_р  зависи още и от формата на липидната молекула: обърнатите конуси са най-силно нарушават структурата на бислоя и са с най-ниска Т_р.  

Молекулен параметър на реда (Sn) (фиг.11): отразява подвижността не само на въглеводородната опашка, а на всички отделни СН₂-групи в нея; може да бъде определен за групи, които са на различно разстояние от полярната глава.

Sn = 3/2 . cos²βn – 1/2      β е ъгълът, който се образува между нормалата към равнината на мембраната  и нормалата към въглеводородния остатък от мембраната (опашката би трябвало да е перпендикулярна на бислоя, но не е; затова е необходимо спускането на нормали).  Sn характеризира ентропията. Sn = 1, когато молекулите са идеално подредени в бислоя; при пълно разхаотизиране на молекулите – Sn = 0. При фазов преход от твърдо в течнокристално състояние Sn трябва да спадне рязко.  Sn може да се определи по няколко начина: ЯМП - чрез деутерирани СН₂-групи – в различно положение сигналът е различен; флуоресценция – белязани поляризирани сонди се потапят в бислоя на определена дълбочина; ДСК – диференциална сканираща калориметрия – определяне количеството топлина, необходимо за нагряване на някакво количество проба; ДАСМ – диференциален адиабатен сканиращ микрокалориметър – тук е възможно измерването на много малки количества проби (фиг.12).

Молекулен механизъм на фазовите преходи

Молекулна основа на този преход са промените, които настъпват в конформацията на въглеводородните вериги, т.е. ротационната изомерия. Когато температурата е достатъчно ниска, топлинното движение е слабо и всички единични С–С връзки на въглеводородните вериги са от типа транс-, т.е. веригите са в пълна транс-конформация. Това означава, че те представляват линейни структури, които са максимално опънати, успоредни една на друга и в близък контакт. Това състояние на бислоя, при което въглеводородните вериги са разположени така, се нарича подредено или гел и то съответства на най-плътна опаковка на липидните молекули. Тяхната подвижност естествено е ограничена. С повишаване на температурата рязко нараства и вероятността за ротационна изомерия. Въртенето около единични С-С връзки на въглеводородните вериги е свободно, тъй като е необходима енергия за преодоляване на отблъскването между атомите. Една липидна въглеводородна верига може да има много ротамери поради големия брой единични връзки. Най- малка енергия има транс (t), а най-голяма цис конформацията (cis), която се получава от нея при завъртане на 180º. Сравнителни малка енергия е необходима за завъртане на веригата на 120º  и преминаване от транс- в гош-конформация. За това е достатъчна и енергията на топлинното движение. Гош-конформацията може да бъде g⁺, когато въртенето е по посока на часовниковата стрелка, и g^– в обратна посока. Появата на единична g-конформация извежда разположената след нея част на веригата от първоначалната равнина и променя нейната посока. Плътно опакованата система от въглеводородни вериги с пълна t-конформация се оказва сериозна пречка за такава промяна и я прави невъзможна. Пространствените затруднения обаче са преодолими, ако след една g ⁺- конформация веригата се завърти още един път на същия ъгъл, но в обратна посока. Тогава веригата като цяло става трансоидална с изключение на участъка от нея в g⁺-t-g^--конформация, който образува извивка, наречена кинк (фиг.13). Енергията на това състояние е двойно по-голяма, отколкото при единична g-конформация. Въртенето около двойна С=С връзка не е възможно при енергии от порядъка на топлинното движение. Но в ненаситената верига е достатъчна само една g-конформация, за да се образува кинк от вида g-t-cis. Появата на единични кинкове облекчава възникването на кинкове в съседни въглеводородни вериги. Освен това двойните цис-връзки в ненаситените вериги благоприятстват възникването на кинкове в съседните им наситени вериги. Получават се кинк-блокове, заемащи части от единия монослой или срещуположни части в двата монослоя на мембраната. Образуването на кинкове води до скъсяване дължината на веригите и увеличаване обема, заеман от една липидна молекула. Структурата на бислоя се променя, тъй като дебелината му се намалява, а разстоянието между липидните молекули се увеличава.

Главен регулатор на флуидноста на мембраната при еукариотите е холестеролът. Намирайки се между въглеводородните вериги, той пречи на кристализацията им, тъй като ги отдалечава една от друга. От друга страна той ограничава техните движения, с което снижава флуидността. По този начин холестеролът поддържа флуидността на мембраната на някакво средно ниво. Холестеролът (опашката му) може да компенсира дефекти в бислоя като запълва пространства, които могат да увредят стабилитета на мембраната (фиг.14).

Динамична структура на липидния бислой

Мембраната е съставена от хидрофобна част, оградена от полярни участъци. Хидрофобната част съдържа изотропни (i) и анизотропни слоеве (а) (фиг.15). Първите са съставени от хомогенни структури, хаотично разположени в пространството. Sn = 0 тук. В разтвор на неполярен разтворител, изотропният слой има силна непроницаемост за заредени частици. Анизотропните слоеве са добре подредени (6 – 8 въглеводородните групи). Между отделните кластери се появяват дефекти – има кухини, които представляват динамична структура, но в тях могат да се включат капчици вода (уловена вода). Кинковете дифундират напречно на липидния бислой. В кухините могат да се поберат малки молекули (СО₂, О₂), които дифундират по дължина заедно с кинка.

Белтъци на биомембраната

Белтъците съставляват общо 25 - 75 % от масата на мембраната. Съотношението липид- белтък е около 50:1. Мембранните белтъци се разполагат в мембраната по различен начин. В зависимост от локализацията на белтъците се различават няколко типа белтъци (фиг.16):

1)        монотопични белтъци – не пронизват липидния бислой.

2)        битопични – пронизват го изцяло.

3)        политопични – пронизват го като правят извивки в бислоя.

В зависимост от свързването си с мембраната, белтъците биват:

1.     периферни – разполагат се отвън и отвътре на мембраната и най- често са фибриларни (фиг.17). Това са ензими или белтъци на цитоскелета. Връзките са електростатични и при нарушаването им периферните белтъци преминават в супернатантата при обработка с разтвори с различно рН и йонна сила и ЕДТА. Ролята на периферните белтъци е разнообразна:

o   те участват в междуклетъчния контакт, диференциация и пролиферация, сигнално-регулаторна функция (пр. белтъци на екстрацелуларния матрикс).

o   белтъците на цитоскелета участват  в поддържане релефа на структурите- структурно-скелетна роля (пр. спектрин при Er).

o   участие в движенията на мембраната-белтъци на микротубулите и микрофиламентите.

2.     интегралните белтъци (фиг.17) са глобуларни (повечето); тези белтъци са вградени в мембраната и с помощта на рН, ЕДТА и йонна сила не се отделят. Те образуват здрави комплекси с прилежащите липиди. Интегралните белтъци участват и в образуването на мембраната.  Тези  белтъци участват и във формирането на канали, през които става преноса на вещества – такива са трансмембранните белтъци.

Най-добре са изучени белтъците на Er. Er са съставени от мембрана, цитоскелет и хемоглобин. При отстраняване на хемоглобина остава само мембраната. В мембраната на Er има до 20 отделни белтъка. От тях  по-добре изучени са:

§  спектрин – фибриларен белтък, съставлява елемент на цитоскелета; образува влакна, всяко от които е от две ППВ. Те образуват димери, които взаимодействат по между си и образуват един тетрамер. Тетрамерът е фибриларна структура. От една страна тя е свързана с актина – спектриновите влакна се свиват и разтеглят, това дава възможност за промяна на формата на Er и техните свойства. По- младите Er са с по-силни еластични свойства и обратно.

§  анкирин – от една страна е свързан със спектрина, а от друга с мембраната и то с белтък на ивица 3. Анкиринът е мост между белтък на ивица 3 от мембраната и спектрина от цитоскелета. При всякакво въздействие-химично вещество, сигнал, температура и т.н. белтъчната мрежа реагира и Er се приспособява към различните условия (тези промени трябва все пак да са в границите на един определен диапазон).

§  гликофорин –това е трансмембранен белтък, Мм = 130 kDa. Участъкът вътре в мембраната е една α-спирала от 20 АК. По- голямата част от белтъка (откъм N-края) е извън мембраната. Към N-края са присъединени до 100 въглехидратни остатъка. Това са прости остатъци (хексози) и остатъци от сиалова и невраминова киселина; те са (–) и хидрофилни. Гликофоринът определя имунните свойства  на Er и кръвната група.

§  белтък на ивица 3 – изграден е от 800 АК. N-края е към вътрешността на мембраната, където белтъкът образува три спирали. Белтъкът участва в йонния транспорт- в преноса на Cl^–  и Н₂СО₃^–.

Подвижността на белтъчните молекули се ограничава от супермолекулни комплекси (бактериородопсин), цитоскелет (спектрин, микротубули), междумембранни контакти.

Междумолекулни взаимодействия в биологичните мембрани

       Няколко типа са:

·        взаимодействие липид-липид – наблюдава се фазово разделяне (хомогенни области, различни по фазови свойства); разширява се силно диапазонът на фазовия преход.

·        взаимодействие белтък-белтък – формират се комплекси, намалява се молекулната подвижност, поява на междумембранни контакти.

·        взаимодействие белтък-липид – липидът и белтъкът взаимно променят свойствата си-възможна е промяна в молекулната подвижност на липида; При т.нар. ануларни липиди увеличаването на подредеността е свързано с намаляване на подвижността.

·        взаимодействие белтък-липиден бислой – наблюдава се модификация на цялата мембрана (фиг.18).

Въглехидрати

Общо съдържание- 10% от сухото тегло на мембраната. ВГХ изпълняват важни функции:

o   участие в междуклетъчните контакти.

o   определят имунните свойства.

o   определят кръвната група.

o   имат рецепторни свойства.

o   определят товара на мембраната.

ВГХ не са самостоятелни (почти), а съществуват като комплекси от гликолипиди и гликопротеини. Представени са от пентози, хексози и техни производни. ВГХ образуват дълги вериги – до 80-100 монозахаридни остатъка. ВГХ се изграждат за сметка на отделни мономерни звена, при което се отделя вода и се образува ковалентна химична връзка – гликозидна. ВГХ участват в поддържането на мембранната асиметрия.  За да изпълняват своите функции, клетъчните мембрани трябва да са асиметрични – вътрешната и външната им повърхност да са различни по състав. В създаването на тази асиметрия участват както липидни така и белтъчни компоненти. Асиметрията на липидите е относителна, тъй като едни и същи липиди могат да се намират както във външния, така и във вътрешния монослой, но с различна концентрация. Белтъците на мембраната са гликопротеини, а техните олигозахаридни вериги се намират винаги от външната страна на мембраната. Това разположение и еднопосочното действие на някои мембранни транспортни системи са други две страни на мембранната асиметрия. Два основни фактора оказват влияние върху последната-обмяната на веществата, тъй като в мембраната непрекъснато постъпват новосинтезирани молекули, а част от наличните се разграждат и това става с различна скорост от двете страни на мембраната. Другият фактор са различни физични взаимодействия на мембранните компоненти помежду им и с обкръжаващата ги среда, които могат да доведат до асиметрично разпределение на липидните молекули. Съществува и т.нар. трансверсална асиметрия – свързана е с неравномерното разпределение на заредените частици от двете страни на мембраната.

ІІ. ТРАНСПОРТ НА ВЕЩЕСТВА

II.1. Особености  на мембранния транспорт и видове мембранен транспорт

Под мембранен транспорт (транспорт на вещества през биомембраните) се разбират процесите, свързани с преминаването през мембраните на малки молекули или йони. При всички видове транспорт се обменя вещество между клетката и околната й среда като се пресича нейната мембрана.

Мембранният транспорт може да бъде няколко вида:

-         в зависимост от количеството на преминаващите през мембраната вещества, той е унипорт (импорт или експорт), ако се пренася едно вещество. Ако клетката пренася едновременно две или повече вещества, говорим за котранспорт – симпорт или антипорт (съответно в една или в противоположни посоки) (фиг.19).

-         мембранният транспорт е пасивен, когато преходът на вещества през липидните и белтъчните компоненти не е свързан с друг разход на енергия, освен този на собствения градиент на пренасящите се частици.

-         активен транспорт – ΔG > 0 и Δμ >0 – изразходва се енергия. В зависимост от източника, се наблюдава първично активен транспорт – тогава когато необходимата за преноса енергия е за сметка на химичния потенциал на друго вещество (пр. реакция на хидролиза на АТФ, енергия на електромагнитното лъчение, свободната енергия от редокси-процесите). Ако енергията е за сметка на осмотичния или електричния потенциал на друго вещество, то транспортът е вторично активен (ΔμН⁺, ΔμNa⁺ ).

II.2. ДИФУЗИЯ

II.2.1 Проста  ДИФУЗИЯ НА НЕЗАРЕДЕНИ ЧАСТИЦИ и ЙОНИ

Дифузията е спонтанен процес на проникване на вещество от област с по-висока концентрация в област с по-ниска в резултат на топлинното хаотично движение на неговите частици (атоми, молекули или йони). Последователността на процесите са: взаимодействие с хидрофобната фаза на повърхността на мембраната от едната страна, дифузия през неполярната зона на мембраната, взаимодействие с водната фаза на повърхността на мембраната от другата й страна и преход в нея. По този начин се пренасят Н₃О, СН₃ОН, СО₂, формалдехид, карбамид, хидроксиламин и др. Механизмите на преминаването им през мембраната са: през хидрофилни канали, формирани от интегрални мембранни белтъци, през динамични дефекти, вградени в хидрофобната зона на мембраната, миграция на кинкове.

Дифузията още може да бъде проста или облекчена в случай, че частиците на дифундиращото вещество се движат самостоятелно или с помощта на преносители, с които образуват комплекси. При дифузия частиците се движат във всички посоки на пространството. В случай на стационарна дифузия количеството вещество внесено във всяка точка е равно на количеството изнесено от нея, така че концентрацията не зависи от времето, а само от разстоянието. Съгласно първия закон на Фик (A.Fick), плътността на потока вещество J е пропорционална на  градиента на концентрацията dc/dx:

J = –D. dc/dx

Знакът (–) означава, че плътността на потока има посока, противоположна на посоката на градиента, т.е. преносът е по посока на по-ниската концентрация. Коефициентът  D определя големината на J (D = J,  ако dc/dx = 1), т.е. той е мярка за скоростта на дифузията и се нарича коефициент на дифузията. За хомогенна мембрана при разлика в концентрациите от двете страни на мембраната (С_II – С_I) и дебелина h е в сила уравнението:

J = D.γ /h (С_I – С_II ) = P. (С_I – С_II)

P- проницаемостта на мембраната за дадено вещество

γ- коефициент на разпределение на системата мембрана/ вода.

Наличието на електрично поле влияе върху дифузията на заредени частици (йони и електрони). В този случай частиците дифундират не само под действие на концентрационния градиент, на и под действие на градиента на електричния потенциал. Дифузията на заредени частици под действие на електрично поле се нарича електродифузия. Електричните градиенти в живите клетки са резултат от различната концентрация на йони от двете страни на техните мембрани и са движещи сили при трансмембранния транспорт на йони. Скоростта на насоченото движение на йоните тогава е постоянна.

За дифузията на йони е в сила електродифузионното уравнение на Нернст-Планк:

J = u.c ( R.T/c . dc/dx –z.F.dφ/ dx )

u = D. z.F/ R.T

- dφ/ dx - интензитетът на полето, изразен с градиента на електричния потенциал.

Изобщо, дифузията на заредени частици се дължи както на въздействието на електрично поле, така и на наличие на концентрационен градиент, т. е. на неравномерност в тяхното разпределение.

Факторите, които определят преминаването на електронеутрални частици са няколко:

·        размер – по-голяма частица, по-трудно преминава през мембраната.

·        наличие на хидратна обвивка – по-малка частица, по-голяма хидратна обвивка.

·        наличие на концентационен градиент – необходимо е концентрацията на разтвореното вещество от двете страни на мембраната да е различна.

·        молекулна маса – колкото е по-голяма частицата, толкова по-трудно ще премине през мембраната.

Силата, която определя този пасивен транспорт, е само и единствено концен-трационният градиент и никакъв разход на енергия.

II.2.2. УЛЕСНЕНА ДИФУЗИЯ

Скоростта на простата дифузия е твърде ниска, за да осигури обмяната на онези количества вещества, необходими за живата клетка. Установено е, че глюкоза, аминокиселини, глицерол и др. проникват в клетката със скорост, която не зависи линейно от разликата в концентрациите им от двете страни на мембраната. В транспорта на молекулите през мембраната взима участие вещество, наречено преносител и затова този вид дифузия е известна като каталитична или улеснена дифузия. Особености на облекчената дифузия:

o   селективност.

o   насищане – с увеличаване на градиента се увеличава и скоростта на преноса, но само до един момент; след това скоростта остава постоянна.

o   чувствителност към инхибитори (подобно на реакциите с ензимен механизъм).

Преносителите могат да бъдат подвижни и неподвижни. Първите работят на принципа на голямата въртележка (фиг.20) – пр. валиномицинът или на принципа на малката въртележка (фиг.20) – пр. пермеазите. В първия случай преносителят минава през мембраната, излиза в извънмембранното пространство от външната страна на клетката, свързва се с веществото, навлиза в мембраната и го освобождава в примембранното пространство от вътрешната страна на мембраната. Другият тип подвижен преносител действа само вътре в мембраната, без да  напуска границите й. Веществото влиза в участъка, където ще се адсорбира от рецепторите, след запълване на всички рецептори с  вещество белтъкът се затваря отвън, отваря се отвътре и веществото влиза в клетката.

Йонният транспорт може да се осъществява чрез няколко вида преносители:

o   йонофори – неутрални и карбоксилатни.

o   циклични депсипептиди, състоящи се от редуващи се АК и α-  оксикиселини (валиномицин).

o   макротетролиди (нактини) – макроциклични структури, включващи 4 лактонни пръстена (нонактини, тетранактини).

o   синтетични макроциклични полиестери – краун-естери с обща формула (СН₂- СН₂О)n - (фиг.21).

Последователността при преминаване през канала е: дехидратация, взаимодействие с молекулните групи на канала, попадане в празна енергетична “яма” за време ~ 10^–13 – 10^–12 sec. Съществува теория за избирателната пропускливост на канала. Тя се базира на електростатичното взаимодействие със селективен филтър. Известна е като теория на йонообменящата селективност (Дж. Ейзенман, 1967 г.). При слабо електростатично поле – редица на Ейзенман: Cs⁺ > Rb⁺ > K⁺ > Na⁺ > Li⁺, каналът е най- селективен за цезий.

При голяма сила на полето подреждането е обратно: Li⁺ > Na⁺ > K⁺ > Rb⁺ > Cs⁺, т.е. каналът е най-селективен за литий.

Подобен на валиномицина, но с нециклична структура, е нигерицинът. Макроцикличните полиестери пренасят K⁺, Na⁺, Ca⁺⁺, Mg ⁺⁺. От 5 – 10 лигандни кислородни атоми  формират стабилни комплекси с катионите на различни метали.

Съществуват природни или небелтъчни синтетични вещества, които избирателно усилват дифузията на молекули през мембраната, но не са естествени преносители. Такива вещества са йонофорите, които могат да образуват с молекулите комплекси с големи размери. Централно място сред йонофорите подвижни преносители заемат отделяните от микроорганизми макроциклични антибиотици, както и синтетичните макроциклични комплексни съединения. Някои от тях са неутрални, тъй като не съдържан йонизируеми групи – цикличните полипептиди и диспептиди. Антибиотиците – подвижни преносители с обща структура, наподобяваща орехова черупка. Пример за такъв подвижен преносител е валиномицинът. Валиномициновият пръстен е съставен от 6 СО-групи, които са (–) заредени; страничните вериги на пръстена са изградени от Val. В липидния бислой валиновите остатъци са обърнати навън, а заредените групи са навътре. При попадане във водна среда, пръстенът се извива, СО-групите излизат навън,а валиновата хидрофобна верига остава отвътре. Валиномициновата молекула е една типична амфифилна молекула. Валиномициновият пръстен е с  диаметър, който отговаря на размерите на хидратиран К⁺. По този начин внасянето на калий се ускорява, без това да влияе на преноса на Na⁺  . Натриевата обвивка е по-голяма от калиевата и той не може да се пренася  чрез този преносител. Валиномицинът е подвижен преносител, действащ на принципа на голямата въртележка: той излиза в примрембранното пространство, ориентиран с СО-групите навън, улавя калиевите йони, извърта се и минава обратно през бислоя. В клетките, той се извърта с СО-групите навън и К⁺ попада във вътрешността на клетката. 

Сред най-известните антибиотици каналообразуватели са грамицидин А, амфотерицин В, аламетицин. Техните молекули имат афинитет и към водната и към органичната фаза, което им дава възможност да образуват воден канал, тъй като лесно пронизват мембраната. Външната част на канала е хидрофобна, а към вътрешността му са обърнати незаредени, добре поляризуеми групи. Всички канали се отварят и затварят спонтанно, така че броят на отворените и затворените канали се мени с времето. Всеки канал пропуска само едновалентни катиони, но не може да пропуска едновременно повече от един катион. За една секунда през един канал могат да преминат повече от 10⁷ йона. Йонофорът грамицидин А е полипептид с отворена верига; молекулата е напълно хидрофобна с изключение на полярните незаредени групи на пептидната верига и крайните полярни групи. Трансмембранният канал  (фиг.22) в този случай е образуван от две молекули грамицидин А. Те са обърнати една към друга със своите N-краища и съставят спирален димер с дължина, равна на дебелината на мембраната. Молекулите на грамицидина имат динамична природа и преминаването на катион разширява и скъсява канала. Това обяснява неговата ниска селективност. Пропускащият йони спирален димер е резултат от установяването на равновесно положение на съставящите го мономери, всеки от които сам не може да пропуска йони. Всеки единичен канал в мембраната се получава при асоциация на два мономера в димер и се разпада при дисоциация на този димер.

Между двата типа преносители има разлики по отношение на действието им. Те се определят от това, че подвижните преносители са температурозависими (при  намаляване на температурата бислоят се втвърдява и валиномицинът не може да премине през него. Грамицидин А не е зависим от температурата; тя не оказва влияние върху пропускливостта на канала. Освен това при него не се наблюдава ефектът на насищане, какъвто има при подвижните преносители. С увеличаване концентрацията на пренасяното вещество се увеличава и скоростта на прехода, но до един определен момент. По-нататък, колкото и да нараства концентрацията на веществото, поради насищане на всички преносители скоростта на преноса няма да се промени.

Съществуват и канали със собствен сензор и рецепторуправляеми канали:

^-          потенциалуправляеми канали- Na⁺, K⁺, Ca⁺⁺, Cl^–

-         лигандуправляеми канали – молекули-антагонисти – ацетилхолин, глутамат, глицин, γ-аминомаслена киселина.

-         канали, управляеми от G-белтъци – активират се при свързване на лиганда с рецептора.

Механочувствителни йонни канали – тези канали (фиг.23) се активират при разтягане на мембраната (strech- activated) или се инактивират (strech- inactivated).

Редица токсини също могат да създават канали. Това пречи на нормалното провеждане на нервния импулс. Такъв токсин е например мелитинът. Той се съдържа в пчелната отрова, действаща на потенциал зависимите йонни канали. Тетрамерът му образува пора с диаметър = 2-3 nm; при рН > 6.6 тя е катион-селективна, а при по-ниски рН през нея минават предимно аниони.

II.3. АКТИВЕН ТРАНСПОРТ НА НАТРИЙ и КАЛИЙ

Основното явление на активният транспорт е концентрирането на калиеви йони от околната среда във вътрешността на клетката. Успоредно с това в противоположна посока се движат натриевите йони, които напускат вътрешността на клетката. Основна движеща сила на йонният транспорт е изменението на потенциала вътре в мембраната. Освен това, потокът на йоните е пропорционален на тяхната концентрация в мембраната. Друг фактор е подвижността на йоните, която от своя страна се определя от вискозитета на липидната фаза в мембраната.

Концентрационните градиенти на Na⁺ и К⁺ не само поддържат обема и йонния състав на клетката в определени граници, но осигуряват и електричната възбудимост на нервните и мускyлните клетки. Освен това те служат и като движеща сила за транспорта на захари и аминокиселини в клетката. Тези градиенти се създават от специфична транспортна система, наречена натриево-калиева помпа (Na⁺/К⁺-ева помпа), тъй като двата йона не се пренасят независимо един от друг.

В присъствието на Na⁺и Мg²⁺ АТФ фосфорилира ензима Na⁺/ К⁺- ева АТФ-аза (начална форма Е₁), при което се образува междинния продукт Е₁-Ф. В присъствието на К⁺ този продукт се хидролизира. За фосфорилирането не е необходим К⁺, а за дефосфорилирането не са необходими нито Na⁺, нито Мg²⁺:

В транспорта на Na⁺ и К⁺ и спрегнатата с него хидролиза на АТФ участват четири конформационни форми на ензима – две крайни (Е₁ и Е₂) и две междинни (Е₁-Ф и Е₂-Ф). Системата е спрегната така, че ако няма транспорт на Na⁺ и К⁺, няма разход на енергия на АТФ, тъй като тогава няма хидролиза на АТФ. При хидролизата на една молекула АТФ през клетъчната мембрана се пренасят 3Na⁺ и 2К⁺ в противоположни посоки. Следователно, помпата създава разлика в електричния потенциал от двете страни на мембраната – тя е електрогенна помпа.

-         Na⁺/К⁺-евата АТФ-аза е олигомерен трансмембранен белтък-тетрамер α₂β₂, съставен от по две полипептидни вериги.

Присъствието на Na⁺ предизвиква фосфорилиране на Е₁ и стабилизиране на Е₂, а присъствието на К⁺-дефосфорилиране на Е₂ и стабилизиране на Е₁. С попадането на Na⁺ в кухината от вътрешната страна на мембраната настъпва хидролиза на АТФ и фосфорилиране на Е₁. Фосфорилирането променя конформацията от Е₁-Ф на Е₂-Ф – кухината се обръща навън. Формата Е₁-Ф има слаб афинитет към Na⁺, поради което те се освобождават навън. Формата Е₂-Ф има силен афинитет към К⁺, които се намират от външната страна на мембраната. Със залавянето на К⁺настъпва дефосфорилиране на Е₂-Ф, но формата Е₂ без фосфорилираната група Ф е нестабилна и се превръща в Е₁. Последната има слаб афинитет към К⁺, поради което те се освобождават навътре и цикълът се затваря (фиг.24).

Има няколко фактора, необходими за наличие на активен транспорт:

-         източник на енергия- това са макроергичните вещества- в случая АТФ.

-         АТФ трябва да е от вътрешната страна на мембраната.

-         структура, която да разгражда АТФ – необходима е АТФ-аза от вътрешната страна.

-         АТФ-азата трябва да е активирана – необходим е Mg²⁺.

-         съответният концентрационен градиент на натрий и калий.

II.4. Протонен транспорт

Протонният транспорт се осъществява по няколко начина:

·           чрез молекули преносители – соли на слаби киселини, амини.

·           чрез подвижни белтъчни молекули преносители.

·           чрез протонни канали – пр. Н⁺-АТФ-ази и АТФ-синтетази, митохондриална Cyt c-оксидаза. Н⁺-каналът се образува от полярните групи на белтъчните молекули, които не участват в образуването на Н-връзки на α-спиралата. Участват около 20 АК (фиг.25).

Целият файл, заедно с фигурите, може да намерите тук